各种人工沉香诱导技术对沉香代谢组的影响

背景

沉香木是一种备受追捧的树脂木材，可用于医药、熏香和香水生产。为了克服与沉香木生产相关的挑战，已经开发了几种人工沉香木诱导处理。然而，这些技术对处理过的木材样品代谢组的影响尚不清楚。因此，本研究旨在评估四种处理的效果：火钻处理 (F)、火钻 + 盐水处理 (FS)、冷钻处理 (D) 和冷钻 + 盐水处理 (DS)) 对乙醇-从A. sinensis中提取的处理过的木材样品的油含量和代谢组谱。

结果

四种处理的乙醇提取油含量差异显着（F < D < DS < FS）。共检测到712种代谢物，主要由生物碱、氨基酸及其衍生物、黄酮类、脂类、酚酸、有机酸、核苷酸及其衍生物、萜类化合物组成。在成对比较中，分别在 F_vs_FS、D_vs_DS、F_vs_D 和 FS_vs_DS 中检测到 302、155、271 和 363 种差异积累代谢物 (DAM)。DAM富含类黄酮/黄酮和黄酮醇生物合成、倍半萜类和三萜类生物合成。通常，在火钻或冷钻处理中添加盐水会降低大多数代谢物的丰度。

结论

这项研究的结果为合成诱导的沉香木生产提供了宝贵的见解。

沉香木是沉香属的芳香树脂填充心材，在全球市场上比黄金更有价值 。沉香木在亚洲国家的佛教、印度教和伊斯兰教的实践中被用作珍贵的香。在中国，它被用作阿育吠陀实践中的传统药物 。此外，沉香的主要活性化合物已被研究用于神经保护、镇静、抗菌和抗炎用途，在最近的药理和化学研究中观察到 。然而，除非受到严重伤害或微生物侵扰，否则健康的沉香树可以生产有限数量的沉香木。沉香的生产主要是通过风或雷击伤害，或通过昆虫和真菌的蚕食。亚洲传统的琼脂木生产方法包括切割、钉钉、钻孔或切割一块树干。这种过度开发的野生沉香属植物，现在有几个物种正在减少和濒临灭绝。

传统的沉香诱导方法和非传统的沉香诱导方法是可用的两种最常见的沉香诱导方法类型。烧伤、凿钻和用斧头伤人等物理侵入的传统程序在中国已经使用了大约 1000 年。其他非传统的诱导策略包括用含有离子或微生物添加剂的溶剂进行树干注射以促进沉香木的生产  和用含有离子但不含任何微生物添加剂的溶剂进行树干注射 。这些诱导方法在中国和其他沉香生产国用于商业沉香生产。由此可见，培育沉香对于生产优质沉香至关重要。虽然最近的一些调查表明非传统生产的沉香木的质量与传统生产的沉香木相当，但其他人报告说这两种沉香木之间存在化学差异  .

中东和东南亚对沉香木作为原料资源的需求旺盛，沉香木既可用于熏香，也可用于药用。全球市场上沉香木的价格因等级而异，从每公斤 6000 美元到每公斤 10,000 美元不等 。此外，1 公斤沉香精油的售价为 30,000 美元。沉香木的整体全球市场份额估计在每年 6 至 80 亿美元之间。传统的感应技术正在研究用于制造沉香木，但此类研究仍处于早期阶段。由于沉香木的生产方法不同，因此绝对需要对化学成分进行比较，以全面了解沉香木的质量和代谢物特征 。需要进一步的研究来阐明非传统技术诱导的沉香木中次生代谢物积累的机制。在对沉香进行处理后的第 20 天，可以检测到色酮的增加。大多数色酮和组合物的比例在受伤 9 个月后稳定。虽然过程尚不清楚，但这些结果表明沉香木形成的复杂动态性质 .

王等人观察到了这一点。盐分胁迫会增加 2-(2-苯乙基) 色酮的产生并调节与沉香植物中信号转导有关的新基因的表达。沉香油的品质受香味和寿命、树脂含量、地理来源和纯度的影响。精油通常来自具有数百种成分的次级代谢产物。然而，据报道，沉香中的油量和质量明显取决于沉香诱导技术。已有关于沉香的代谢物特征的先前研究 。2-(2-苯乙基)色酮 (PEC) 等代谢物是沉香中最重要的芳香族化合物 。使用液相色谱-质谱 (LC-MS) 和核磁共振 (NMR) 进行色酮分析，将色酮分为三组：四氢-2-(2-苯乙基) 色酮 (THPEC)、环氧-(2-苯乙基) 色酮 (EPEC) ) 和二环氧-(2-苯乙基)色酮 (DEPEC)。大量研究表明，色酮和倍半萜对于沉香的药用和熏香应用都是必不可少的 。_ 最近，研究表明沉香中色酮的数量在整个沉香生产过程中会发生波动 ，但 2-(2-苯乙基) 色酮已显示在优质沉香中显着积累.

几种传统的方法可以近似野生沉香的形成过程。然而，传统方法既费力又耗时 。据报道，新的非传统处理方法可在沉香木中产生较高但较慢的次生代谢物和油积累 。大量沉香诱导方法已被开发出来，包括培养沉香试剂盒（CA-kit）、全树沉香诱导技术（Agar-Wit）和生物诱导沉香诱导技术（Agar-Bit）。CA-kit 结合物理伤害和化学诱导，诱导沉香通过使用放置在伤口中的通气装置将诱导物质注射到伤口中来促进树木生长 。这种方法生产出高质量的沉香木，但该程序对人类健康和环境的影响还有待研究。此外，Agar-Wit 会产生更大的伤口，因为诱导剂通过蒸腾作用通过植物维管组织。输血装置中的预加载诱导剂通过植物蒸腾作用传播，从而导致沉香木的覆盖面积更大，但组织破坏更多。具体来说，使用了多种方法，包括部分修剪的树、燃烧的凿钻树和真菌接种树，以诱导Aquilaria sinensis树脂形成。他们发现，从 Agar-Wit 诱导法提取的沉香木质量高于现有方法提取的沉香木。类似地，Agar-bit 程序通过植物蒸腾分配诱导试剂，除了将试剂直接注入树的茎中，这导致试剂的分布更均匀。

先前利用气相色谱-质谱 (GC-MS) 或 NMR 的研究为沉香木中的特定倍半萜提供了证据 。因此，我们使用各种诱导策略对A. sinensis处理的沉香木的乙醇提取油含量及其代谢组谱进行了这项研究。这些发现为未来研究沉香的商业生产提供了重要信息。

植物材料、处理和取样

沉香木样品产自中国广东省化州市平定镇一个 9 年树龄的A. sinensis种植园。使用此类示例不需要任何权限。样品的正式鉴定由徐大平教授进行，没有存入凭证样本。共调查了基于火钻处理(F)、火钻+盐水处理(FS)、冷钻处理(D)和冷钻+盐水处理(DS)的12种人工伤人沉香木。盐水是质量分数为 26% 的氯化钠溶液。

火钻处理：我们在炉子里加热钻头（温度约为750°C），立即开始钻树干。我们使用胸高直径为 10 cm 的A. sinensis，并在距离树干上方地面 50 cm 处钻过树干。孔直径为 1.5 厘米，孔间距为 25 厘米（共 4 个孔）。对于消防演习+盐水处理，穿孔后用盐水冲洗受伤的树干。

对于冷钻处理：使用钻头（不加热钻头）在距离地面 50 厘米处穿过树干钻孔。孔直径为 1.0 厘米，孔间距为 25 厘米（总共 4 个孔）。对于冷钻+盐水处理，穿孔后用盐水冲洗受伤的树干。木材在处理后 4 周收获用于分析 [。

所有处理均应用于三棵不同的树（生物复制），在本实验中涉及 12 棵树。处理后，用刀对树干的变色部分进行取样（图 1）。在打孔部位下方 5 厘米处采集样品（深度 3 厘米，半径 5 厘米的半圆）。将所有木材样品放入液氮中并运送到实验室。将木材样品在液氮中粉碎成粉末并放入超低温冰箱（- 80°C）中，直到进行后续分析以备后用。

本研究中A. sinensis造成的伤口。A.消防演习处理。B.消防演习+盐水处理。C.冷钻处理。D.冷钻+盐水处理

乙醇提取木材样品中的油并进行定量

光照和温度暴露导致木材样品失去挥发性化合物，因此将它们在暗室中风干并在凉爽的环境温度（4  ° C）下储存在袋子中。所有植物材料在提取程序之前都进行了尺寸减小，以优化样品分散、热传递、细胞内容物的获取以及乙醇从细胞内容物中的释放。用锯子将木头切成小块，每块木头在切割后都用小刀切碎。为了防止在提取过程的最后阶段挥发性化合物的损失，使用松下磨粉机粉碎碎木头。根据 Samadi 等人，通过超声辅助溶剂法提取样品。称取两克（2g）样品，50℃干燥48h至恒重，测定水分含量。将干燥后的样品放入 100 ml 锥形瓶中，加入 50 ml 95% 乙醇。在 60 °C 和 37 K Hz 的条件下，将干燥的样品在超声波清洗机（德国，ElmasonicP300H）中提取两次，每次 30 分钟。用 95% 乙醇补充质量损失。溶液过滤后，将 8 mL 滤液（每管 2 mL）在 Vacufuge plus Vacuum Concentrator（德国，Eppendorf concentrator 5301）中蒸发。然后，将滤液在 60°C 下蒸发 3 h。之后，称重盘子，并确定其中的乙醇提取油的量。

制备用于代谢物提取的样品

将来自四个处理的三克 (3 g) 样品（三个生物复制品（12 个样品））冻干，然后使用 MM400 混合器与 15 mm 的氧化锆珠在 30 Hz 下持续 1.5 分钟粉碎成粉末。将 100 mg 粉末样品在 1.0 mL 中在 4 ° C 的 70% 甲醇水溶液中提取过夜， 并在 10000 rpm 下离心 10 分钟以吸收提取物。将提取物过滤并转移到新鲜的液相色谱-质谱 (LC-MS) 管中。质量控制 (QC) 分析通过结合样品提取物来验证重复分析的变化以验证数据。分析是根据早期的协议 进行的。

代谢物检测和评估

使用 MetWare 数据库 ( http://www.metware.cn ) 进行了具有多种目标的综合代谢物分析。基于二级光谱信息对代谢物进行定性分析。多反应监测 (MRM) 模式下的三重四杆质谱仪也用于完成代谢物定量。主成分分析 (PCA) 用于可视化数据集中各组之间和组内的变异性。具有 log2FC > 1 阈值和可变投影重要性 (VIP) 的正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 允许产生差异累积代谢物 (DAM)。对 DAM 进行了功能注释 在 KEGG 数据库的帮助下。使用 LC-ESI-MS/MS 系统分析沉香提取物的代谢物谱（HPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 系统，京都，日本；MS，Applied Biosystems 6500 Q TRAP，圣地亚哥，加利福尼亚，美国） . 分析条件改编自 Chen 等人。HPLC 流出物交替连接到电喷雾电离 (ESI)-三重四极杆-线性离子阱-MS/MS 系统（Applied Biosystems 4500 Q TRAP，San Diego，CA，USA）。使用多反应监测 (MRM)和 MetWare MWDB 数据库根据其标准代谢操作程序 进行代谢物量化。

数据分析

首先，进行质量控制（QC）分析以确保数据在进行后续分析之前是可靠的。质量控制样品是通过组合沉香样品来监测重复分析的变化。为了进行统计分析，将沉香木样品上传到 AB Sciex 的 Analyst 程序（版本 1.6.1；AB Sciex，加拿大），其中包含具有代谢物总离子强度的数据矩阵。在将代谢物提交给 KEGG 分析之前，使用正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 进行变量选择。当使用投影中的变量重要性 (VIP) 参数时，确定了每种代谢物与 OPLS-DA 模型的相对相关性。VIP > 1 和倍数变化 2 ≥ 0.5 被用作标准 。R 中的 prcomp 函数（版本 3.3.2；www.r-project.org）用于创建 PCA 和 Ward 的层次聚类热图。按照KEGG（https://www.genome.jp/kegg）构建了一条生物合成途径；并且基于与对照相比代谢物浓度的变化，使用 MetaboAnalyst ( http://www.metaboanalyst.ca ) 进行了通路分析。

不同处理对沉香木乙醇提取油含量的影响

我们使用略加修改的超声辅助溶剂萃取法 从火钻处理 (F)、火钻 + 盐水处理 (FS)、冷钻处理受伤的中华冬青中提取和量化乙醇提取的油含量（D）和冷钻+盐水处理（DS）（图1）。4个处理对乙醇提油率（%）的影响顺序为DS（0.143±0.022%）>FS（0.140±0.020%）>D（0.113±0.007%）>F（0.085±0.035%）（表S1；图 2 )。这表明在 F 或 D 中添加盐水都会增加中华曲霉中乙醇提取的油含量相对于没有盐水的对应物（分别为 F 和 D）。总的来说，我们推断不同的处理会影响处理过的沉香的数量和质量。

四种处理（火钻处理（F）、火钻+盐水处理（FS）、冷钻处理（D）和冷钻+盐水处理（DS））乙醇提取油含量的变化。 . 条形代表三个生物重复的平均乙醇提取油含量，误差条表示标准偏差

四种不同诱导技术产生的沉香木的靶向代谢组分析

从A. sinensis生产的沉香木的数量和质量受到植物施加的压力或微生物攻击的高度影响 。由于我们观察到不同处理对沉香沉香油产量的影响，我们进一步使用 Ultra-Performance Liquid对沉香沉香样品（4 次处理 × 3 次生物重复）进行了广泛靶向的代谢组分析。色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）。

从 UPLC-MS/MS 中，我们在四种处理（F、FS、D 和 DS）中共检测到 712 种化合物。这些化合物由 122 种脂质、109 种酚酸、78 种有机酸、72 种黄酮类化合物、69 种氨基酸及其衍生物、53 种生物碱、41 种核苷酸及其衍生物、25 种萜类化合物、18 种木脂素和香豆素、10 种单宁和 115 种其他化合物组成（图 3 A ）。我们对 712 种代谢物的离子强度进行了热图聚类和主成分分析 (PCA)。四种处理及其生物重复分为两个主要组（图3乙）。集群 I 仅包含来自 FS 的样本，而集群 II 包含 F、D 和 DS。这一趋势表明，与其他三种处理相比，FS 相对独特。PCA 的结果表明，712 种代谢物的 79.89% 的变异性可以用前 3 个主轴解释）在每种处理的 12 个样品中，其样品组合在一起（图S1 A-C）。在热图聚类和 PCA 中观察到的生物复制的分组模式表明本研究中代谢组谱的质量很高。

来自A. sinensis 的沉香木样品的代谢组学分析。A.将 712 种检测到的代谢物分为 11 类。B.热图聚类显示本研究中应用的四种处理之间的相关性。绿色、巧克力色、中石板蓝和洋红色分别代表来自火钻处理 (F)、火钻 + 盐水处理 (FS)、冷钻处理 (D) 和冷钻 + 盐水处理 (DS) 的样品。化合物类别及其离子强度显示在图例中

沉香四沉香中差异积累代谢物的鉴定

我们进一步对 712 种化合物进行了成对比较中的差异累积分析，使用 OPLS-DA 在 log2FC ≥ 1 的阈值和投影中的变量重要性 (VIP) ≥ 1 的判别分析。从该分析中，总共有 302、155、分别在 F_vs_FS、D_vs_DS、F_vs_D 和 FS_vs_DS 中获得了 271 和 363 种差异积累的代谢物（DAM）（图 4；补充表S2 AD）。F_vs_FS 和 D_vs_DS 中的大多数 DAM 大量减少（图4）。这意味着与它们的对照（F和D）相比，添加盐水处理降低了代谢物积累的程度（表 1）。这种趋势与 K-means 聚类的结果基本一致（图 3）。 5）。相反，与 F 和 FS 相比，D 和 DS 样品中大多数代谢物的丰度分别增加（图4；表1）。这表明与火钻处理相比，冷钻改善了代谢物的积累。

在来自A. sinensis的四对沉香木组中检测到差异积累的代谢物。火钻处理（F）、火钻+盐水处理（FS）、冷钻处理（D）和冷钻+盐水处理（DS）获得的四个样品

基于火钻处理 (F)、火钻 + 盐水处理 (FS)、冷钻处理 (D) 和冷钻 + 盐水诱导的沉香代谢物的标准化离子强度（log10 转换）的差异累积代谢物 K 均值聚类在A. sinensis中进行处理 (DS) 。子类和代谢物编号显示在每个图的顶部。彩色线代表标准化离子强度，而黑色线代表每个子类中代谢物标准化离子强度的平均值

我们在四个成对组之间进行了比较分析，并确定了保守的 DAM（图S2）。这表明四种处理在沉香沉香的诱导代谢组变化方面具有一定程度的相似性（图3 B）。

沉香木差异积累代谢物的KEGG通路富集分析

我们对在p值 < 0.05的成对组中检测到的 DAM 进行了 KEGG 通路富集分析。黄酮类生物合成被检测为涉及四个成对组的共同途径，具有 14 种独特的代谢物（表1；图 6A）。其中 10 种代谢物在 F 样品中高度积累；六种黄酮类化合物在 FS 中高度积累，九种黄酮类化合物在 D 或 DS 中高度积累（图6A）。例如，5-O-咖啡酰莽草酸在 FS > F > D 中积累（图6 A）。另一个例子是柚皮素，它在 F、D 和 DS 中相对平均地积累，但在 FS 中不存在（图6一个）。这些结果表明黄酮类生物合成途径参与调节沉香木生产的沉香木的质量。

四种处理（火钻处理（F）、火钻+盐水处理（FS）、冷钻处理（D）和冷钻+盐水处理（DS））在A.中华_ 类黄酮/黄酮和黄酮醇的生物合成。带上标ff的化合物参与黄酮和黄酮醇的生物合成，而b参与黄酮类/黄酮和黄酮醇的生物合成。B倍半萜和三萜生物合成。C次生代谢物的生物合成。四种处理（F、FS、D 和 DS）中的代谢物丰度水平（离子强度）进行了 log10 转换。红色表示高丰度，而深蓝色表示代谢物的缺失或低积累（参见图右侧的图例）

除了上面阐述的类黄酮/黄酮和黄酮醇生物合成外，来自倍半萜类和三萜类生物合成的三种代谢物在处理过程中差异积累和诱导。例如，与缺乏这些化合物中的至少一种的 FS 或 D 相比，Taraxerol、Costunolide 和 Valencene 在 F 和 DS 中的丰度更高（表2；图6 B），这表明只有用盐水进行的火钻和冷钻关键化合物涉及倍半萜类和三萜类生物合成。

在次生代谢物生物合成的富集途径中，共发现了 28 种化合物，包括 2 种生物碱、4 种氨基酸及其衍生物、9 种黄酮类化合物、2 种木脂素和香豆素、5 种有机酸、2 种其他和 3 种酚酸（表2；图. 6 C)。与 F 相比，FS 中大多数代谢物的丰度降低。然而，相对于 D，DS 中观察到相反的趋势。

总的来说，KEGG通路富集分析表明，黄酮类/黄酮和黄酮醇生物合成、倍半萜类和三萜类生物合成可以作为通路工程的目标，以提高沉香木生产的数量和质量。此外，它还证实了四种处理对沉香代谢组和质量的不同影响。

2-(2-苯乙基)色酮和已知与沉香木形成和质量属性有关的衍生物的积累

许多先前的研究报道，2-（2-苯乙基）色酮及其衍生物是沉香木形成和质量的关键成分 。对于实际的遗传改良，已表明 2-(2-苯乙基) 色酮及其衍生物是沉香木中沉香木形成的关键生物标志物[ 8 ]。因此，我们在 F_vs_FS、D_vs_DS、F_vs_D 和 FS_vs_DS 中检测到的 DAM 中专门筛选了 2-(2-苯乙基) 色酮和衍生物。我们共检测到九个 2-(2-苯乙基) 色酮及其衍生物（图 7）。所有九种化合物都存在于F中，积累最多的是8-羟基-2-（2-苯乙基）色酮、6-羟基-2-（2-羟基-2-苯乙基）色酮和8-氯-2- (2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮。与 F 不同，FS 处理仅累积四种化合物（8-羟基-2-（2-苯乙基）色酮、6-羟基-2-[2-（3′-甲氧基-4′-羟基苯乙基）]色酮、8- Chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone 和 7-methoxy-2-(2-Phenylethyl) chromone。因此，我们推测 F 处理诱导与 FS 相比，沉香木形成率更高，质量属性更好。相反，在 D 中鉴定出六种化合物，但 8-Hydroxy-2-(2-phenylethyl) chromone、6-Hydroxy-2-(2-hydroxy-2-phenylethyl) chromone 除外和 6-羟基-2-[2-(3′-甲氧基-4′-羟基苯乙基)]色酮 (图 1)。7）。D 中最丰富的代谢物是 6-Methoxy-2-(2-phenylethyl) chromone 和 5-Hydroxy-6-methoxy-2-(2-phenylethyl) chromone。将 DS 与 D 进行比较，DS 仅诱导 8-Chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone 的积累，这在其他三种处理中始终如一地检测到（F、FS 和 D）。因此，这种特定化合物可能需要进一步研究，以揭示其参与调节沉香木形成和质量属性的过程。通常，向 F 或 D 中添加盐水会减少代谢物的数量，如表1和图7所示。

在四种处理（火钻处理（F）、火钻+盐水处理（FS）、冷钻处理（D）和冷钻+盐水）中检测到的九种2-（2-苯乙基）色酮及其衍生物的热图治疗（DS））。红色表示高丰度，而深至海蓝色表示代谢物的缺失或低积累（参见图右侧的图例）。丰度水平是三个生物重复的平均值，平均水平经过 log10 转换

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尽管沉香植物如A. sinensis需要很长时间才能发育，沉香的形成过程也需要相当长的时间，但对沉香及其衍生物的需求正在上升。为了克服这一点，A. sinensis被故意伤害以生产沉香 。沉香木的数量和质量有据可查，受位置和诱导技术的影响[。因此，本研究旨在分析使用或不使用盐水的火和冷钻技术诱导的沉香沉香的代谢组（图1）。获得的乙醇提取油量范围为 F 中的 0.085 ± 0.035% 至 DS 中的 0.143 ± 0.022%（图2）。早期的研究表明，人工生产的沉香木中乙醇提取的油含量发生了变化。本研究中四种处理方法的乙醇提取油含量高于化学生产的沉香木中报道的含量[ 48 ]。然而，我们的结果与 Zhang 等人的类似报告相比较。在Lasiodilodia theobromae (Pat.)。因此，本研究中应用的四种处理方法可以为改善沉香木的形成提供有前景的技术。然而，本研究并未评估这些处理对乙醇提取油质量属性的影响。因此，未来的研究必须评估这些技术对沉香木质量的影响。

植物具有一系列酚类化合物，例如黄酮类化合物、木质素、芪、单宁和木脂素，它们是莽草酸途径的苯丙氨酸或酪氨酸副产物的产物。从代谢组学分析中，712 种次级代谢物包括 122 种脂质、109 种酚酸、78 种有机酸、72 种黄酮类化合物、69 种氨基酸及其衍生物、53 种生物碱、41 种核苷酸及其衍生物、25 种萜类化合物、18 种木脂素和香豆素、10 种单宁和 115 种未知物质检测到化合物（图3A）。这些化合物中的大多数已在先前的研究中报道，以说明沉香木在熏香、香水和药物中的价值 。例如，据报道，本研究中鉴定的儿茶素、表儿茶素和芦丁具有抗氧化活性和抗诱变特性。。这些化合物分为两个主要簇，FS 为簇 I，而 D、DS 和 F 形成另一个簇（图3 B）。这一趋势在乙醇提取油含量的统计分析中几乎遵循了相同的趋势（图2），表明这两种处理方法都改变了沉香木中的代谢组谱。我们进一步对 712 种化合物进行了严格标准的差异分析。将 F 与其对应物与盐水（FS）进行比较，共有 302 种代谢物，其中 217 种被下调，85 种被上调（图4；补充表S1一个）。例如，3-Hydroxy-4′,5,7-Trimethoxyflavanone（类黄酮）作为 F 中最丰富的化合物，在 FS 中积累了 18.77 倍（补充表S1A）。这意味着与本研究中的对照相比，向 F 中添加盐水大大减少了代谢物的积累。相反，四种酚酸（(S)-2-Hydroxy-3-(4-Hydroxyphenyl) propanoic acid；3-(Hydroxymethyl) phenol；Dihydrocaffeic acid and 1,3-O-Di-p-Coumaroylglycerol）（VIP = 1.21 –1.22；log10FC = 10.13–14.21) 在 FS 中累积，但在对照 (F) 中完全不存在。这表明添加盐水改变了沉香沉香的代谢组学特征。

同样，我们比较了 D_vs_DS 并检测到 155 种差异积累的化合物，其中 94 种下调和 61 种上调（图4；补充表S1B）。这与 F_vs_FS 的趋势一致。然而，最丰富的代谢物（Nootkatone（萜类化合物））在 D 中的积累比在 DS 中低 2.40 倍（补充表S1 b）。此外，冷钻中加入盐水会产生 2-（4-羟基苄基）-4-（甲氧基甲基）苯酚；对香豆酸-4-O-葡萄糖苷和丁香醛-4-O-葡萄糖苷（酚酸）、2-羟基异丁酸（有机酸）、赫巴塞丁（类黄酮）和甲基多巴（氨基酸及其衍生物）控制（D）（补充表S1乙）。这表明盐水和冷钻可能会产生具有更丰富代谢物含量的沉香。

四种处理中最显着的途径改变是黄酮类化合物/黄酮和黄酮醇的生物合成，在成对比较中具有 18 个 DAM（图6A）。大多数差异富集的类黄酮化合物在 F 中的丰度高于 FS，而 DS 的差异富集类黄酮化合物的丰度高于 DS。这并不奇怪，因为在几项关于A. sinensis沉香木形成的研究中已经报道了黄酮类生物合成。此外，在四种处理中，三种代谢物（Taraxerol、Costunolide 和 Valencene）在倍半萜和三萜生物合成中的富集程度不同（表2；图6 ）乙）。这些化合物是倍半萜，据报道是沉香的主要成分之一。这些代谢物的丰度表明，与对应物（分别为 FS 和 D）相比，F 和 DS 处理可能会影响沉香木的质量。代谢工程可能是提高沉香木质量而不对A. sinensis施加可避免压力的策略之一。

此外，由生物碱、氨基酸及其衍生物、黄酮类、木脂素和香豆素、有机酸、酚酸和其他化合物组成的28种代谢物明确参与了次生代谢物的生物合成（表1；图6C）。这些可以作为代谢工程的目标，以提高沉香木的产量和质量。其中一种化合物是水杨酸，据报道它会诱导沉香木的形成。基本上，已知水杨酸会诱导伤口周围的防御反应，并进一步产生倍半萜和苯乙基色酮。随后，这会导致在伤口位置形成沉香木。用或不用盐水的冷处理诱导了六种 2-(2-苯乙基) 色酮和衍生物，这与 Naziz 等人的报道相反。这些 2-(2-苯乙基) 色酮及其衍生物在影响沉香品质 、化学分离 、药理作用 等方面的作用近年来备受关注。] 及其生物合成途径。总之，在 F 中检测到 9 个 2-(2-苯乙基)色酮及其衍生物，而在 FS、D 和 DS 中分别检测到 4 个、6 个和 1 个（图7）。未来的研究可以评估四种处理对沉香品质、2-(2-苯乙基)色酮及其衍生物的类型和含量的影响。我们的研究结果为帮助A. sinensis育种努力提高沉香木产量和质量提供了推动性的见解。

本研究分析了四种非传统沉香木生产方法及其对沉香油和代谢组谱的不同影响。我们的研究结果表明，各种处理，火钻，火钻+盐水处理，冷钻和冷钻+盐水处理用于沉香诱导沉香对沉香木的乙醇提取油含量和代谢组谱有显着影响。向防火钻或冷处理中添加盐水可产生更高的乙醇提取油。通常，在火钻或冷钻处理中加入盐水可减少大多数检测到的代谢物的积累。检测到的差异积累代谢物主要富含类黄酮/黄酮、黄酮醇、倍半萜和三萜生物合成。该研究为通过四种非传统方法诱导的沉香的乙醇提取油含量和代谢组谱提供了重要的见解，这将有助于评估商业沉香的生产。